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    勁馬生物|如何制備免疫血清?

    發布時間: 2022-05-18  點擊次數: 58次

    血清是血液離體自然凝固后分離出來的液體.人血管中抽出的血液,直接放入空試管中,不做任何抗凝處理,血液逐漸發生凝固,數小時后慢慢縮小并釋放出黃色的液體稱之為血清 


    免疫血清的制備

    一,原理  

    具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖,分化形成漿細胞并分泌特異性抗體.由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別,因此由某一抗原刺激機體后產生的抗體,實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體).另外,抗體的產生具有回憶應答的規律性,牨m現為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應答特點截然不同.這是由于記憶性B細胞參與再次應答所致.  


    二,免疫方法  

    根據抗原的性質不同而異.下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明.  

    1. 用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛,以酒精及碘酒消毒皮膚;  

    2. 第一次免疫:用2ml注射器吸取乳化的抗原(人IgG)下稱(FCA-IgG)液1ml,每側腳掌皮下各注入0.5ml.  

    3. 第二次免疫:間隔10-14天后,于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入FCA-IgG,每個淋巴結注0.1ml,其余注入淋巴結附近皮下共1ml.如淋巴結未腫大或腫大不明顯時,直接注入兩側 窩及鼠蹊部皮下.  

    4. 間隔7-10天后,從耳靜脈采血0.5~1.0ml,分離血清,以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血).效價至少應達到1∶16以上時才能放血.  

    5. 若效價未達到要求,可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內注射免疫.即于1周內注射3次,分別為0.1,0.3,0.5ml.間隔1周再試血.如效價達到要求應立即放血.另外,也可在第2次免疫后,以乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次.注射部位,劑量和間隔均同第2次,再試血測抗體效價,如效價達到要求立即放血.  


    三,放血  

    (一) 心臟采用血法  

    1. 家兔仰面,四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定);  

    2. 剪去左胸部兔毛,消毒皮膚;  

    3. 用左姆指摸到胸骨劍突處,食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟,并使心臟固定于左胸側位置.然后,以左拇指觸摸心臟搏動最強的部位;  

    4. 用50ml注射器(連接16號針頭),傾針45°角度,對準心搏最強處刺入心臟抽血致死;  

    5. 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中,待凝固后分離血清.  

    (二) 頸動脈放血法  

    1. 家兔仰臥同上固定.頭部略放低以暴露頸部.剃毛及消毒皮膚;  

    2. 沿頸部中線切開皮膚約10cm,分離皮下組織,直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突??;  

    3. 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織,暴露出頸總動脈后使之游離;  

    4. 于動脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠心及近心端.結扎遠心端的絲線.近心端的動脈用血管夾夾??;  

    5. 用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口,插入塑料放血管.再將近心端的絲線結扎固定于放血管上,以防放血管滑脫;  

    6. 松開血管夾,使血液流入滅菌三角燒瓶中.一般一只家兔可放血80~100ml.  


    四,分離血清  

    將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時,再置4℃冰箱內3~4小時.待血液凝固收縮后,用毛細滴管吸取血清.于3000rpm離心15分鐘,取上清加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉,最終濃度),分裝后置4℃冰箱中保存備用.  


    五,結果鑒定  

    以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價,并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質量,應產生單一的沉淀弧線.鑒定方法的具體步驟參見有關部分。


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